İnsanlığın elindeki en güçlü yüz güldürücü biyolojik kimliklendirme silahı: PCR

Akademik Akıl’ın fikir babası olan Başyazar Prof.Dr. Hikmet AKGÜL’ün “Her şey akıl ve bilimle olur” paradigmasına günümüzde katkı veren birçok bilim dalı, teknik, yöntem ve teknolojik cihaz bulunmakla birlikte, PCR (Polymerase Chain Reaction) tekniğinin, özellikle tıp alanında yeri doldurulamaz geçerli ve güvenilir akademik veri ürettiği yadsınamaz bir gerçektir. Ancak son zamanlarda, başta bilim camiası olmak üzere bütün insanlığın denendiği, Covid-19 pandemisindeki pozitif vakaların tespit edilmesi için kullanılan tekniklerden en önemlisi olan PCR hakkındaki dilemmaya açıklık getirmek gerekliliği doğmuştur. Bu gereklilik bu yazının kaleme alınmasına neden olmuş olup, yazının hedef okuyucu kitlesi PCR uygulayıcısı olmayan bilim insanları, araştırmacılar ve gündeminde Covid-19 olan bütün insanlardır.

PCR nedir, nasıl çalışır?

Günümüzde insanlığın elindeki en güçlü yüz güldürücü biyolojik kimliklendirme silahı “PCR” dır. PCR, DNA içindeki özgün bir bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak (amplifikasyon) için uygulanan tepkimelere verilen ortak bir isimdir. In vitro ortamda DNA amplifikasyon yöntemi olarak da bilinir. PCR; 94°C- 98°C aralığında çift iplikçi DNA’nın iki zincirinin yüksek ısıya maruz bırakılarak ayrılması (stabil tek zincir eldesi, denatürasyon), 37°C-65°C aralığında gerçekleştirilen oligonükleotidlerin (polimerizasyon başlatıcısı, primer) hedef DNA’ya bağlanması (hibridizasyon, annealing) ve 72 °C’de gerçekleştirilen baz ekleme (polimerizasyon, uzama) gibi ardıl tekrarlı basamaklardan ibaret enzimatik bir reaksiyondur.

Öncesinde çok sayıda yapılan bilimsel araştırmaya rağmen PCR, ilk kez Saiki ve ark tarafından 1985 yılında geliştirilen ve DNA’nın hücre içindeki üretimine eşdeğer şekilde, cansız bir ortam olan tüp ortamında üretilmesine olanak sağlayan bir enzimatik yöntemdir. Yöntem, tamamen hücresel bir reaksiyonun hücre dışında ve tüp ortamında gerçekleştirilmesine olanak sağlamıştır. Tüp ortamında, bir canlı hücre tarafından gerçekleştiriliyormuş gibi hedef DNA sentezini kusursuzca başarması, PCR tekniğini bu amaç için kullanılan diğer teknik, yöntem ve cihazlardan daha üstün kılmaktadır. Hücrenin normal fonksiyonunda herhangi bir değişiklik yapılmadan, in vitro ortamda hücrenin bu görevine %100 eşdeğer bir reaksiyon oluşturulmaktadır. Eppendorf tüp hariç reaksiyon için kullanılan bütün parametreler biyolojik ürünlerden ibarettir. Özetle, “Hücre, yapmakta olduğu çok sayıdaki fonksiyonlarından bir tanesini tüp ortamında gerçekleştirmektedir” şeklinde tanımlamak yanlış olmayacaktır.

PCR tekniğinin en önemli silahlarından biri, reaksiyon ortamına konan Thermus aquaticus bakterisinden elde edilen ve 200°C’de fonksiyon yapabilen Taq DNA polimeraz enziminin cansız tüp ortamında hücre içindeymiş gibi DNA sentez aktivitesi göstermesidir. Diğer ve PCR’ı vazgeçilmez kılan silahı ise; reaksiyon ortamına konulan ve amplifiye edilmek istenilen gen/dizileri üst düzey doğrulukla sentezlenmesine olanak sağlayan reaksiyon başlatıcılarıdır (Primer çifti). Çok iyi bilindiği gibi, bütün biyolojik sistemin kalıtsal materyali DNA ve RNA’dan ibarettir. DNA çift zincir yapısından ibaret olup zincirler birbirinin komplementerleridirler (tamamlayıcı, template, eşleyici, mate). Bu çift heliks DNA eşleşmesi, bütün biyolojik sistemlerde hücrenin sahip olduğu en gizemli ve kesinlikle hata kabul etmeyen neredeyse tek işlemidir. Eşleşme, aynaya bakmak ve her şeyin tersini görmek şeklindedir. Böylece hücrelerin bu mükemmel özelliği PCR ile tüp ortamına taşınmış olur ve reaksiyon ortamına konan primer çifti ile birebir sağlanmaktadır. Araştırmacı, hangi organizmayı ve/veya ona ait gen/genlerin sentezini hedefliyorsa, o gen bölgesiyle %100 doğrulukla komplementerlik özelliğiden dolayı eşleşebilen (hibridizasyon) ve uygun sentezlenmiş oligonükleotidleri (primer) tüp ortamına koyarak, hedeflediği geni üst düzey bir spesifikasyonla amplifiye eder. Ortama konan primer dizilerinde bir tek yanlış ve/veya eksik baz seçilimi durumunda primer-hedef gen eşleşmesi bozulur ve PCR reaksiyonun başarı ile sonuçlanması engellenir. PCR tekniğinin %100 doğrulukla akademik veri üretme kabiliyeti de buradan gelmektedir (primer-hedef gen/dizi eşleşmesi).

Özetle PCR:

• Isı kontrollerinin bilgisayarla yapıldığı bir enzimatik reaksiyondur
• Hücreye ait bir fonksiyonun tüp ortamında (in vitro) -cansız ortamda- gerçekleştirilmesi esaslıdır
• Tüm bileşenleri biyolojiktir
• Bütün dünyada uygulanan tanı ve/veya araştırma amaçlı hiçbir test, PCR üstünde ve/veya düzeyinde geçerli ve güvenilir akademik bir veri henüz üretememektedir.

PCR’ın uygulama alanları nelerdir?

Kriminolojik analizler – suçlu ve adi suçlar, hırsızlık, tecavüz, paternite analizleri; babalık testleri, bebek çalınmaları, sehven karıştırmalar, Biyoteknoloji, GDO ürünlerin eldesi ve verifikasyonu; rekombinant protein eldesi, biyoteknolojik ürünler, biyomühendislik alanında yeni biyocihazların geliştirilmesi gibi giderek yükselen ve çeşitlenen disiplinlerarası uygulama alanları bulunmaktadır. Bu uygulama alanlarının en önemlileri şu başlıklarda toplanabilir:

• Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı
• Gen tedavisi ve DNA aşıları
• Tanı amaçlı prob sentezi, hedef gen/dizi sentezi
• Paternite ve Forensik (adli tıp) tıp analizleri
• Antropolojik analizler
• Mutagenezisde prenatal, postnatal genetik tanı
• Homolojik araştırmalar
• Rekombine protein eldesi
• Klinik örneklerde patojen organizmaların (virus, bakteri, mantar, protozoon vs) saptanması

2000’li yılların başında NASA tarafından gerçekleştirilen ve bütün dünyada biyoteknoloji ve moleküler teknolojisinin önünü açan İnsan Genom Projesinin (Human Genome Project) en büyük silahı yine PCR olmuştur.

Fetal ve/veya kanser hücrelerine ait periferik dolaşımda eser düzeyde bulunan, fragmente DNA analizinde kullanılan likit biyopsi ve aptamer analizi, yine PCR tekniği ile başarılmaktadır.

Biyomühendislik ve biyoteknolojik ürünlerin sentezi, transformasyon ve/veya transfeksiyon takipleri primer olarak PCR tekniği ile başarılmaktadır. Bu alanlarda güncel yenilikçi gelişmeler şu alt gruplarda toplanabilir:

• • Beyaz Biyoteknoloji

Endüstriyel ürün eldesinde kullanılan çeşitli konak organizmalar, hücre, enzim ve uygulamalarının tamamı “Beyaz Biyoteknoloji” olarak adlandırılır. Burada temel amaç, biyoteknolojik enstrümanlar kullanılarak insanlığın ihtiyacını karşılayacak (global açlık ve savaşları sonlandırmak amacı ile) düşük maliyetli ve çok miktarda ürün eldesi ve bu ürünlerin kullanım sonrasında tamamının kolay imha edildiği doğaya artık olarak geri dönüşümü olmayan ürünlerin elde edilmesidir.

• • Yeşil Biyoteknoloji

Endüstriyel ürün eldesinde kullanılan çeşitli konak organizmalar, hücre, enzim ve uygulamaların tamamı “Yeşil Biyoteknoloji” olarak adlandırılır. Bu alanda üretilecek rekombine ürünlerin çeşitli zararlılara, iklim koşullarına dayanıklı olmaları sağlanmakta ve böylece ekosisteme adaptasyonları çok yüksek düzeyde olmaktadır.Ayrıca diğer wild türlerle olası rekabette de başarılı ürünlerdir. Günümüzde bütün dünyada yaygın olarak kullanılan GDO ürünleri, bu dalın en önemli çıktılarıdır. Bu teknolojinin bütün uygulamalarının her basamağı PCR ile verifiye edilmektedir.

• • Kırmızı Biyoteknoloji

Biyoteknolojik enstrumanların sağlık alanındaki uygulamalarının tamamı böyle adlandırılır. Hastalıkların tanı, tedavi ve rehabilitasyonunda kullanılan bütün cihaz, ilaç ve kimyasalların tamamı bu alana girmektedir. Yeni ilaç teknolojileri, hastaya özel uygulamalar, gen tedavisi uygulamaları bunların başında gelmektedir.

• • Mavi Biyoteknoloji

Deniz, okyanus ve içilebilir su kaynaklarında yaşayan fitoplankton, zooplankton ve organizmalarının moleküler biyolojik yöntemler kullanılarak miktarlarının ve dayanıklılıklarının arttırılması, bu biyoteknoloji alanının temel hedefidir. Suda yaşayan organizmaların gerek çeşitliliğini ve gerekse miktarlarını arttırmak burada temel amaç olarak karşımıza çıkmaktadır.

• • Gri Biyoteknoloji

Bu biyoteknoloji ile hava, çevre kirliliği analizleri ve ekosistemler tarafından meydana getirilen gaz değişimlerinin analizi ve temizlenmesi amaçlanmaktadır. Hava kirleticilerinin ileri biyoteknolojik analizleri ve bu fabrika ve/veya sistem odaklı kirleticilerin modifiye edilmesi yolu ile ekosistem üzerine olası zararlı etkilerini önlemek temel hedeftir.

• • Karanlık (siyah) Biyoteknoloji

Biyolojik silah eldesini konu alan biyoteknoloji alt dalıdır. Biyoteknolojik uygulamaların lokal, ulusal ve uluslararası etik kurullarca büyük bir titizlikle denetlenmesi gereken bir daldır. Çoğu zaman bilim insanları tarafından mesafeli durulmakla birlikte önlenemez bir cazibesi olan uygulama alanıdır. Günümüzde çeşitli sebeplerden ötürü gelişim ivmesi en düşük alandır.

PCR’ın test güvenirliği nedir?

Covid-19 pandemi sürecinde PCR testleri ile ilgili yapılan tespitler doğru mudur?

PCR’ı teknik olarak hücreye eşdeğer ve vazgeçilmez kılan özelliği, reaksiyon için tüp ortamına konan 16-18 bazdan ibaret reaksiyon başlatıcıları olan “primerler” dir. Bu primerler hücrelerin bölünme öncesi DNA’larını iki katına çıkarmak için kullandıkları önemli reaksiyon başlatıcılarıdır. Bu yazıda DNA replikasyonu mekanizması anlatılmayacaktır; çünkü nasıl bir mekanizma olduğu, hücre için nasıl bir hata kabul etmez reaksiyon olduğu, en küçük bir replikasyon hatasının hücre ölümü dahil nasıl bir ağır fatura ödettiği ilgili birçok akademik kaynağa ulaşmak mümkündür. Bu yazıda özellikle dikkat çekmek istediğim konu, geçirmekte olduğumuz Covid-19 pandemi sürecinde PCR tekniği ile ilgili speküle edilen tekniğin yetersiz olduğu şeklindeki görüşlere yönelik olacaktır.

Çevremizde, fiziki olarak görmediğimiz ve haberdar olmadığımız birçok biyolojik objeyi veya ona ait DNA dizilerini %100 oranla görünür kılan bir test olması sebebiyle PCR, insanlığın geliştirdiği güçlü bir biyolojik kimliklendirme silahıdır. Son yıllarda tıpta tanısal amaçlı geliştirilen likit biyopsisi, PCR’ın yüksek spesifitesi özelliği ile geliştirildi. Baş döndüren bir hızla insan yaşantısına giren ileri teknolojinin yanı sıra, PCR’ın çok daha komplike biyolojik sorunların çözümünde ve teknoloji üretiminde tahmin edilemeyecek düzeyde bir potansiyele sahip bir teknik olduğunu söylemek kanımca yanlış olmayacaktır. PCR, her ne kadar çok yaygın kullanılıyor olsa da, özellikle uygulayıcısı dışındaki akademisyenlerce etki mekanizmasının çok da iyi anlaşılmadığını düşünmekteyim. Aksi takdirde, güncel pandemi sürecinde Covid-19 olgularında PCR’ın tanısal etkinliğinin %60’ın altında bir doğruluğa sahip olduğu iddia edilemezdi. Bu konuda gerek ülkemizde ve gerekse uluslararası PCR kullanıcısı olmayan otoritelerce yanlış tespit ve yorumlar yapılmaktadır. Mevcut yazı, bu konudaki yanlış ve/veya eksik görüşlerin düzeltilmesine katkı vermek amacıyla kaleme alınmıştır. Bu hata düzeltilmez ise adli otorite denetiminde yapılan paternite analiz raporlarının da %60 hata içerdiği anlamı çıkarılabilecektir. Böyle bir durumda, insanlar bu oranda çocuğun kendisine ait olamayabileceğini düşünebilecek ya da cenazesi PCR kimliklendirme ile teslim edilen ve defnedilen kişilerde soru işaretleri kalabilecektir; ki gerçek bu değildir.

PCR tekniği hücre içi reaksiyonun tıpatıp aynısı olduğu için, biyolojik kimliklendirmede günümüzde hiçbir test ve cihazın üretemeyeceği düzeyde bir akademik veri üretmektedir ve akredite bir laboratuvar tarafından bütün bilimsel gereklilikleri yerine getirilirse, üretilen veri %100 doğrulukta olmaktadır. PCR’ın bütün reaksiyon koşulları optimum sağlanırsa, biyolojideki “ya hep ya hiç” kuralı gibi çalışır. Reaksiyon tüpünde hedef DNA dizileri varsa pozitif, yoksa negatif sonuç verir. PCR, reaksiyon olarak böyle bir hataya sebebiyet vermez ama PCR amaçlı kullanılan ticari kit ve/veya testlerin hataya neden olabileceği düşünülebilir.

Olası hata kaynakları şunlar olabilir:

1. Çok iyi optimize edilmemiş PCR tabanlı ticari kit zafiyeti;
   1. Reaksiyon için mikron konsantrasyonunda olması gereken parametrelerin (primer, dNTPs, taq polimeraz enzim, enzim ko-faktörleri, hedef DNA vs) yetersizliği ve uygunsuzluğu
   2. PCR reaksiyon koşullarının uygunsuzluğu
   3. Reaksiyon ortamına spesifikasyon amaçlı konulan primer çiftinin uygunsuzluğu
2. Akredite olmayan laboratuvar ve deneyimsiz teknik eleman tarafından yapılan uygulamalar. Kullanılan kitin PCR optimizasyon sorunu varsa tekrar sayısı ve hata oranı da o oranda artacaktır.
3. Hastadan sağlanan biyolojik örnek sorunu; biyolojik örnekten izole edilen DNA ve/veya RNA örneklerinde amplifiye edilmek istenilen hedef DNA dizileri yok veya eser düzeyde olabilir. Diğer taraftan çok iyi optimize edilmiş PCR testlerinde eppendorf tüpüne konan hastaya ait DNA örneği, değil eser düzeyde, tek kopya olması durumunda bile pozitif sonuç olmak mümkündür. PCR tekniğinin hassasiyeti ve spesifikasyonu diğer eşdeğer testlerle kıyaslandığında bu durumdadır.
4. Özellikle lizojeni (Lizojeni: virus, konak hücreyi enfekte ettikten hemen sonra, kendisi için optimum koşullar yoksa, kendi DNA ve proteinlerinin üretimini erteleyerek DNA’sını konak genoma entegre etmesi, lizojenik patwayi seçmesi ve kendisi için optimum koşulları beklemesi, optimum koşullar sağlandığında kendi DNA/RNA sentezini yaparak, hücre ölümüyle sonuçlanan litik patwayi seçmesi) yapmış kimerik viral ve/veya bakteriyel orijinli DNA varlığında virüs veya bakteri genomu hangi hücre ve dokuya lizojeni yapmışsa örnek bu dokudan alınmadığı sürece reaksiyon tüpünde hedef diziler olamayacağı için hasta virüs taşıyıcısı (pozitif) olduğu halde negatif test sonucu elde edilecektir. Burada biyolojik enzimatik bir reaksiyon olan PCR tekniğinin herhangi bir hatası yoktur. Bu bireyler viral pozitif oldukları halde bukkal smear, kan veya burundan alınan sürüntü örneklerinde viral lizojeni olmadığı için, doğal bir sonuç olarak PCR sonuçları negatif çıkacaktır. Bu pozitif bireyler ağır geçecek ko-enfeksiyon ve/veya re-enfeksiyon durumlarında bağışıklık sistemleri viral yükle baş edemedikleri yaşam periyotlarında virüs lizojeniyi terk edip litik fazı geçerse periferal dolaşımda viral partiküller olabileceğinden, başlangıçta negatif iken sonraki test sonucu pozitife dönebilecektir.
5. Laboratuvar hijyen koşulları ve mikropipet handling’i (el becerisi) iyi olmayan teknik eleman kaynaklı kontaminasyon.
6. Viral gende meydana gelen kalıcı mutasyonlar. Bu mutasyonlar sebebiyle viral genomun tanı amaçlı hazırlanan primer spesifikasyonu ortadan kalkar ve virüsün varlığına rağmen test negatif sonuç verir.

Bu hataların hiçbirisi, biyolojik bir enzimatik reaksiyon olan PCR’dan kaynaklanmamaktadır. PCR’dan kaynaklandığını söylersek bütün biyolojik sistemlerde bölünmek üzere DNA’sını replike etmek isteyen bütün hücrelerde de bu oranda hata olabileceğini kabul etmek lazım ki, hiçbir hücrenin %60 oranında replike edilmiş veya hatalı replike olmuş bir genomik DNA ile devam etmesinin mümkün olmadığını biliyoruz.

Kaldı ki hücre, bazı durumlarda tek bir baz değişikliği ile bile yoluna devam edemeyebilir (letal baz transisyonları).

Dolayısıyla hatalı sonuçların, hücresel enzimatik bir mekanizmanın birebir yansıması olan PCR dan öte, bu amaçla geliştirilmiş ve çeşitli basamaklarında optimizasyon sorunu olan ticari test kitlerinden kaynaklandığını yüksek bir sesle tekrarlamak istiyorum.

Otuz yıl gibi kısa ömrüne rağmen PCR, ürettiği bu tartışma kabul etmez akademik kanıt ile tıp, biyomühendislik ve biyoteknoloji alanlarında çığır açmıştır. Özellikle genetik bilim dalının son dekatta diğer bilim dallarına oranla logaritmik gelişmesinin önünü açmıştır. İnsanlık tarihinde popülasyonların, doğru homolojik determinasyonları ile tarihsel bakışa yepyeni bir bilimsel yaklaşımın önünü açabilir. Bu sebeple, insanlık tarihimizin doğru okunması adına uluslararası bilim insanlarının önüne yeni bir proje koymak isterim. İstenirse insanlık tarihi açısından bilinmeyenler, karanlıkta kalan bütün olaylar, göç yolları vb. konular “İNSANLIĞIN ELİNDE EN GÜÇLÜ YÜZ GÜLDÜRÜCÜ BİYOLOJİK KİMLİKLENDİRME SİLAHI” olan PCR’ın ürettiği akademik kanıtlarla aydınlığa kavuşturulabilir. Güncel literatür, kesin kanıt yokluğu sebebiyle cezaevinde yıllarca yatan ve daha sonra tamamen PCR’ın ürettiği kanıtlarla masumiyeti ispatlanan ve özgürlüğüne kavuşturulan suçsuz insanların verileriyle doludur. Buradan yola çıkarak, insanlık tarihinin bilim ve teknoloji yetersizliğine bağlı olarak çok sayıda yanlışlıklarla dolu olduğunu var saymak çok büyük bir hata olmayacaktır. Özetle insanlık tarihinin, iyi niyetli olunsa bile PCR gibi güçlü bir tanı aracı olmadığı için çaresizce yapılan hatalarla dolu olduğu varsayılabilir. Bu sebeple yaklaşık 30 yıldır tanı amaçlı kullanılan PCR, insanlığa doğruya en yakın bilgi üretmenin ve haksızlıkları/yanlışlıkları daha kolay çözebilmenin önünü açmıştır. Günümüzde uçak kazaları, savaş vb. sebeplerle meydana gelen toplu ölüm ve katliamlarda ceset transferleri, yine PCR’ın insanlığa sağladığı kesin ve doğru verilerle olanaklı olmuştur. Bu konuda saygın dergilerde yayımlanmış çok sayıda güncel yazı bulunmaktadır.

Bütün insanlığın güvendiği, yaklaşık 30 yıldır onunla nefes almaya başladığı neredeyse güvenilir tek test PCR iken, son dönemlerde yapılan yorumların yanlışlarla dolu olduğunu anlamak zor değildir. Viral genom analizinde kullanılan testin validitesi ve spesifikasyonu düşük olabilir; bu sebeple yanlış sonuç üretebilir. Bu durum kesinlikle PCR’a mal edilmemelidir ve bu yanlış kanı bir an önce düzeltilmelidir.

Sonuç olarak PCR, mükemmel işleyen hücre içi gizemli reaksiyonlardan bir tanesinin tüp ortamına aktarıldığı mükemmel bir tekniktir. Test, gerekli bilimsel koşullar eksiksiz sağlandığında geçerliliği ve güvenirliği tam olan (%100) akademik veri üretmektedir. Bu sebeple PCR, gelecekte insan yaşamında etkinliği giderek artan bir teknik olmaya devam edecektir. Bu nedenlerden dolayı PCR’ı tanıyan tüm akademisyenler gibi ben de PCR’ı çok seviyorum. Gelecekte enzim-substrat, hormon-reseptör gibi anahtar – kilit sistemi ile çalışan hücre içi gizemler tüp ortamına, PCR’a eşdeğer spesifikasyon ve özgüllükte aktarılana kadar da sevmeye devam edeceğim.